F-box proteiner er receptorer, der rekrutterer phosphorylerede substrater til SCF ubiquitin-ligase kompleks
Vi har rekonstitueret ubiquitineringsvejen for Cdk-hæmmeren Sic1 ved anvendelse af rekombinante proteiner. Skp1, Cdc53 og F-box-proteinet Cdc4 danner en kompleks, SCFCdc4, der fungerer som en Sic1 ubiquitin-ligase (E3) i kombination med ubiquitin-konjugeringsenzymet (E2) Cdc34 og El. Cdc4 samlet med Skp1 fungerer som receptoren, der selektivt binder phosphoryleret Sic1.
Grr1, et F-box-protein involveret i Cln-destruktion, danner komplekser med Skp1 og Cdc53 og binder phosphoryleret Cln1 og Cln2, males ikke Sic1. Fordi bestanddelene i SCF-komplekset er medlemmer af proteinfamilier, vil SCFCdc4 sandsynligvis tjene som prototype for en stor klasse af E3’er dannet af kombinatoriske interaktioner mellem beslægtede familiemedlemmer. SCF-komplekser forbinder proteinkinase-signalveje til kontrol af proteinoverflod.
Feedbackhæmning af det udfoldede protein response ved GADD34-medieret dephosphorylering af eIF2alpha
Fosforylering af alfa-underenheden af eukaryot translation initieringsfaktor 2 (eIF2alpha) på serin 51 integrerer generel translation undertrykkelse med aktivering af stress-inducerbare gener såsom ATF4, CHOP og BiP i det udfoldede proteinrespons. Vi forsøgte at identificere nye gener, der var aktive i denne phospho-eIF2alpha-afhængige signalvej ved at screene et bibliotek med rekombinante retrovirus for kloner, der hæmmer ekspressionen af en CHOP :: GFP-reporter.
Et retrovirus, der koder for COOH-terminalen for vækststop og DNA-beskadigelsesgen (GADD) 34, også kendt som MYD116 (Fornace, AJ, DW Neibert, MC Hollander, JD Luethy, M. Papathanasiou, J. Fragoli og NJ Holbrook. 1989. Mol. Cell. Biol. 9: 4196-4203; Lord KA, B. Hoffman-Lieberman og DA Lieberman. 1990. Nucleic Acid Res. 18: 2823) blev isoleret og viste sig at dæmpe aktivering af CHOP (også kendt som GADD153) ved både proteinfoldning i det endoplasmatiske reticulum og aminosyremangel.
På trods af regular aktivitet af de beslægtede stress-inducerbare eIF2alpha-kinaser PERK (også kendt som PEK) og GCN2, blev phospho-eIF2alpha-niveauer markant reduceret i GADD34-overudtrykkende celler. GADD34 dannede et kompleks med den katalytiske underenhed af proteinphosphatase 1 (PP1c), der specifikt fremmede dephosphorylering af eIF2alpha in vitro.
Mutationer, der interfererede med interaktionen med PP1c, forhindrede dephosphorylering af eIF2alpha og blokerede dæmpning af CHOP ved GADD34. Ekspression af GADD34 er stressafhængig og var fraværende i PERK (-) / – og GCN2 (-) / – celler. Disse fund implicerer GADD34-medieret dephosphorylering af eIF2alpha i en negativ feedback-loop, der inhiberer stressinduceret genekspression, og som kan fremme genopretning fra translationel hæmning i det udfoldede proteinrespons.
Molekylær karakterisering af 128-kDa immunodominant antigen af Helicobacter pylori associeret med cytotoksicitet og sår i tolvfingertarmen ???
Helicobacter pylori har været forbundet med gastritis, mavesår og gastrisk adenocarcinom. Vi rapporterer nukleotidsekvensen og ekspressionen af et immundominant antigen af H. pylori og immunresponset mod antigenet below sygdom.
Antigenet, der hedder CagA (cytotoksin-associeret gen A), er et hydrofilt, overfladeeksponeret protein på 128 kDa produceret af de fleste kliniske isolater. Størrelsen på cagA-genet og dets protein varierer i forskellige stammer ved hjælp af en mekanisme, der involverer duplikering af regioner inden i genet. Kliniske isolater, der ikke producerer antigenet, har ikke genet og er ikke i stand til at producere et aktivt vakuolerende cytotoksin.
En ELISA til påvisning af immunresponset mod et rekombinant fragment af dette protein detekterer 75,3% af patienterne med gastroduodenale sygdomme og 100% af patienterne med sår i tolvfingertarmen (P <0,0005), hvilket antyder, at kun bakterier, der huser dette protein, er forbundet med sygdom.
Konstrueret GFP som en very important reporter i planter
BAGGRUND
Det grønne-fluorescerende protein (GFP) fra vandmændene Aequorea victoria er for nylig blevet brugt som en universel reporter i en bred vifte af heterologe levende celler og organismer.
Selvom det er vellykket i nogle planteforløbne ekspressionsassays baseret på stærke promotorer eller virale vektorer med højt antal kopier, kræves yderligere forbedring af ekspressionseffektivitet og fluorescerende intensitet for at GFP kan være nyttigt som en markør i intakte planter. Her rapporterer vi, at en omfattende modificeret GFP er en alsidig og følsom reporter i en række levende planteceller og i transgene planter.
RESULTATER
Vi viser, at en re-manipuleret GFP-gensekvens med de foretrukne kodoner af stærkt udtrykte humane proteiner giver 20 gange højere GFP-ekspression i majsbladceller finish den oprindelige vandmand GFP-sekvens.
Når det kombineres med en mutation i kromoforen, udskiftning af serinen i place 65 med en threonin, giver den nye GFP-sekvens mere finish 100 gange lysere fluorescerende signaler ved excitation med 490 nm (blåt) lys og hurtigere kromofordannelse.
Vi viser også, at denne modificerede GFP har en bred anvendelse i forskellige forbigående ekspressionssystemer og muliggør let påvisning af svag promotoraktivitet, visualisering af proteinmålretning ind i kernen og forskellige plastider og analyse af signaltransduktionsveje i levende enkeltceller og i transgene planter.
KONKLUSIONER
Den modificerede GFP er et simpelt og økonomisk nyt værktøj til direkte visualisering af promotoraktiviteter med en bred vifte af styrke og cellespecificitet. Det kan bruges til at måle dynamiske reaktioner på signaltransduktionsveje, transfektionseffektivitet og subcellulær lokalisering af kimære proteiner og bør være egnet til mange andre anvendelser i genetisk modificerede levende celler og væv fra højere planter. Knowledge antyder også, at kodonanvendelseseffekten kan være universel, hvilket tillader design af rekombinante proteiner med høj ekspressionseffektivitet i evolutionært fjerne arter såsom mennesker og majs.
Et forsøg med etanercept, en rekombinant tumornekrosefaktorreceptor: Fc-fusionsprotein hos patienter med reumatoid arthritis, der modtager methotrexat
BAGGRUND
Patienter, der behandles med methotrexat til reumatoid arthritis, forbedres ofte, males har fortsat en aktiv sygdom. Denne undersøgelse blev foretaget for at bestemme, om tilsætningen af etanercept, en opløselig tumornekrosefaktorreceptor (p75): Fc-fusionsprotein (TNFR: Fc), til methotrexatbehandling ville give yderligere fordele for patienter, der havde vedvarende reumatoid arthritis på trods af at de modtog methotrexat.
METODER
I et 24-ugers dobbeltblindt forsøg tildelte vi tilfældigt 89 patienter med vedvarende aktiv reumatoid arthritis på trods af mindst 6 måneders methotrexatbehandling i en stabil dosis på 15 til 25 mg pr. Uge (eller så lave som 10 mg pr. Uge i patienter, der ikke tåler højere doser) for at få enten etanercept (25 mg) eller placebo subkutant to gange ugentligt, mens de fortsætter med at få methotrexat. Det primære mål for klinisk respons var American Faculty of Rheumatology-kriterier for en forbedring på 20 procent i målinger af sygdomsaktivitet (ACR 20) efter 24 uger.
RESULTATER
Tilsætningen af etanercept til methotrexatbehandling resulterede i hurtig og vedvarende forbedring. Efter 24 uger opfyldte 71 procent af patienterne, der fik etanercept plus methotrexat, og 27 procent af dem, der fik placebo plus methotrexat ACR 20-kriterierne (P <0,001); 39 procent af de patienter, der fik etanercept plus methotrexat, og Three procent af dem, der fik placebo plus methotrexat, opfyldte ACR 50-kriterierne (for en forbedring på 50 procent) (P <0,001). Patienter, der fik etanercept plus methotrexat, havde signifikant bedre resultater i henhold til alle målinger af sygdomsaktivitet. De eneste bivirkninger forbundet med etanercept var milde reaktioner på injektionsstedet, og ingen patienter trak sig ud af undersøgelsen på grund af bivirkninger forbundet med etanercept.
KONKLUSIONER
Hos patienter med vedvarende aktiv reumatoid arthritis var kombinationen af etanercept og methotrexat sikker og veltolereret og gav signifikant større klinisk fordel finish methotrexat alene.
